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La fotosíntesis se ve en una nueva luz por pulsos rápidos de rayos X


La capacidad de transformar la luz solar en energía es una de las hazañas más notables de la naturaleza. 


por Richard Harth, Universidad Estatal de Arizona


Los científicos entienden el proceso básico de la fotosíntesis, pero muchos detalles cruciales siguen siendo esquivos, ocurren en dimensiones y escalas de tiempo fugaces consideradas demasiado minúsculas para sondear.

Ahora eso está cambiando.

En un nuevo estudio, dirigido por Petra Fromme y Nadia Zatsepin en el Biodesign Center for Applied Structural Discovery, la Facultad de Ciencias Moleculares y el Departamento de Física de ASU, los investigadores investigaron la estructura del fotosistema I (PSI) con pulsos de rayos X ultracortos en el European X-ray Free Electron Laser (EuXFEL), ubicado en Hamburgo, Alemania.

PSI es un gran sistema biomolecular que actúa como un convertidor de energía solar que transforma la energía solar en energía química. La fotosíntesis proporciona energía para toda la vida compleja en la Tierra y suministra el oxígeno que respiramos. Los avances en desentrañar los secretos de la fotosíntesis prometen mejorar la agricultura y ayudar en el desarrollo de sistemas de almacenamiento de energía solar de próxima generación que combinen la eficiencia de la naturaleza con la estabilidad de los sistemas de ingeniería humana.

«Este trabajo es tan importante, ya que muestra la primera prueba de concepto de la cristalografía en serie de megahercios con una de las proteínas de membrana más grandes y complejas en la fotosíntesis: el fotosistema I», dice Fromme. «El trabajo allana el camino hacia estudios resueltos en el tiempo en el EuXFEL para determinar películas moleculares de la ruta de los electrones conducida por la luz en la fotosíntesis o visualizar cómo los medicamentos contra el cáncer atacan las proteínas que funcionan mal».

El EuXFEL, que recientemente comenzó a funcionar, es el primero en emplear un acelerador lineal superconductor que produce nuevas y emocionantes capacidades que incluyen tasas de repetición de megahercios muy rápidas de sus pulsos de rayos X, más de 9000 veces más rápido que cualquier otro XFEL, con pulsos separados por menos de 1 millonésima de segundo. Con estas explosiones increíblemente breves de luz de rayos X, los investigadores podrán grabar películas moleculares de procesos biológicos fundamentales mucho más rápidamente y probablemente impactarán en diversos campos, incluyendo medicina y farmacología, química, física, ciencia de materiales, investigación energética, estudios ambientales, electrónica, nanotecnología y fotónica. Petra Fromme y Nadia Zatsepin son coautoras corresponsales del artículo, publicado en la edición actual de la revista Nature Communications .

Fuerza en números

Fromme es el director del Centro de Biodiseño para el Descubrimiento Estructural Aplicado (CASD) y lidera los esfuerzos del equipo experimental del proyecto, mientras que Zatsepin dirigió el equipo de análisis de datos XFEL.

«Este es un hito importante en el desarrollo de la cristalografía en serie de femtosegundos, basándose en el esfuerzo bien coordinado de un gran equipo internacional interdisciplinario y años de desarrollos en campos dispares», enfatiza Zatsepin, ex profesor asistente de investigación en el Departamento de ASU de Física y Biodiseño CASD, y ahora investigador principal en la Universidad La Trobe en Australia.

Christopher Gisriel, coprimer autor del artículo, trabajó en el proyecto mientras era investigador postdoctoral en el laboratorio Fromme y está entusiasmado con el proyecto. «La rápida recopilación de datos en experimentos de cristalografía en serie de femtosegundos hace que esta técnica revolucionaria sea más accesible para aquellos interesados ​​en la relación estructura-función de las enzimas. Esto se ejemplifica en nuestra nueva publicación en Nature Communications que muestra que incluso las estructuras de proteínas más difíciles y complejas pueden resolverse por cristalografía en serie de femtosegundos mientras se recopilan datos a una tasa de repetición de megahercios «.

«Es muy emocionante ver el arduo trabajo de las muchas personas que impulsaron este proyecto para materializarse», dice Jesse Coe, coautor que se graduó el año pasado con un Ph.D. en Bioquímica de ASU. «Este es un gran paso en la dirección correcta hacia una mejor comprensión del proceso de transferencia de electrones de la Naturaleza que se ha perfeccionado durante miles de millones de años».

La fotosíntesis se ve en una nueva luz por pulsos rápidos de rayos X
Petra Fromme es la directora del Centro de Biodiseño para el Descubrimiento Estructural Aplicado (CASD) y lidera los esfuerzos del equipo experimental del proyecto. Crédito: Instituto de Biodiseño en ASU

Ciencia extrema

Un XFEL (para láser de rayos X de electrones libres ) suministra luz de rayos X que es mil millones de veces más brillante que las fuentes convencionales de rayos X. Los brillantes pulsos de rayos X similares a un láser son producidos por electrones acelerados a una velocidad cercana a la luz y alimentados a través del espacio entre series de imanes alternos, un dispositivo conocido como ondulador. El ondulador obliga a los electrones a agitarse y agruparse en paquetes discretos. Cada uno de los racimos de electrones que se mueven perfectamente sincronizados emite un potente y breve pulso de rayos X a lo largo de la trayectoria de vuelo del electrón.

En la cristalografía en serie de femtosegundos, se inyecta un chorro de cristales de proteínas en la trayectoria del haz XFEL pulsado a temperatura ambiente, proporcionando información estructural en forma de patrones de difracción. A partir de estos patrones, los científicos pueden determinar imágenes a escala atómica de proteínas en condiciones cercanas a las nativas, allanando el camino hacia películas moleculares precisas de moléculas en el trabajo.

Los rayos X dañan las biomoléculas, un problema que ha plagado los esfuerzos de determinación de la estructura durante décadas, que requiere que las biomoléculas se congelen para limitar el daño. Pero las ráfagas de rayos X producidas por un XFEL son tan cortas, duran solo unos pocos femtosegundos, que la dispersión de rayos X de una molécula se puede registrar antes de que ocurra la destrucción, similar al uso de un obturador rápido de cámara. Como punto de referencia, un femtosegundo es una millonésima de una billonésima de segundo, la misma proporción que un segundo es a 32 millones de años.

Debido a la sofisticación, el tamaño y el costo de las instalaciones de XFEL, solo cinco están disponibles actualmente para tales experimentos en todo el mundo, un cuello de botella severo para los investigadores, ya que cada XFEL generalmente solo puede albergar un experimento a la vez. La mayoría de los XFEL generan pulsos de rayos X entre 30 y 120 veces por segundo y puede tomar de varias horas a días recopilar los datos necesarios para determinar una sola estructura, y mucho menos una serie de fotogramas en una película molecular. EuXFEL es el primero en emplear un acelerador lineal superconductor en su diseño, lo que permite la sucesión más rápida de pulsos de rayos X de cualquier XFEL, lo que puede reducir significativamente el tiempo necesario para determinar cada estructura o fotograma de la película.

Alto riesgo, alta recompensa

Debido a que la muestra es borrada por los intensos pulsos de rayos X, debe reponerse a tiempo para el siguiente pulso de rayos X, que requiere que los cristales de PSI se entreguen 9000 veces más rápido en el EuXFEL que en los XFEL anteriores, a una velocidad de chorro de aproximadamente 50 metros por segundo (160 pies por segundo), como una manguera de incendios microfluídica. Esto fue un desafío ya que requiere grandes cantidades de la preciosa proteína contenida dentro de cristales uniformes para alcanzar estas altas velocidades de chorro y evitar el bloqueo del sistema de entrega de muestras. Las proteínas de membrana grandes son tan difíciles de aislar, cristalizar y entregar al haz, que no se sabía si esta clase importante de proteínas podría estudiarse en el EuXFEL.

El equipo desarrolló nuevos métodos que permitieron PSI, que es un gran complejo que consta de 36 proteínas y 381 cofactores, que incluyen las 288 clorofilas (los pigmentos verdes que absorben la luz) y tiene más de 150,000 átomos y es más de 20 veces más grande que las proteínas estudiadas anteriormente. en el EuXFEL, para determinar su estructura a temperatura ambiente con una resolución notable de 2.9 angstrom, un hito significativo.

Miles de millones de microcristales de la proteína de membrana PSI, derivados de las cianobacterias, tuvieron que cultivarse para el nuevo estudio. Se requirió un rápido crecimiento de cristales a partir de semillas de nanocristales para garantizar la uniformidad esencial del tamaño y la forma de los cristales. La PSI es una proteína de membrana, que es una clase de proteínas de gran importancia que han sido notablemente difíciles de caracterizar. Sus elaboradas estructuras están incrustadas en la bicapa lipídica de la membrana celular. Por lo general, deben aislarse cuidadosamente en forma totalmente activa de su entorno nativo y transformarse en un estado cristalino, donde las moléculas se empaquetan en cristales pero mantienen toda su función nativa.

En el caso de la PSI, esto se logra al extraerla con detergentes muy suaves que reemplazan la membrana y rodean la proteína como un tubo interno de la piscina, que imita el ambiente de la membrana nativa y mantiene la PSI completamente funcional una vez que está dentro de los cristales. Entonces, cuando los investigadores iluminan los pigmentos verdes (clorofilas) que captan la luz mediante el sistema de antena de PSI, la energía se usa para disparar un electrón a través de la membrana.

La fotosíntesis se ve en una nueva luz por pulsos rápidos de rayos X
Nadia Zatsepin, ex profesora asistente de investigación en el Departamento de Física y Biodiseño CASD de ASU, ahora es investigadora sénior en la Universidad La Trobe en Australia. Crédito: Instituto de Biodiseño en ASU

Para mantener la PSI completamente funcional, los cristales solo se empaquetan débilmente y contienen un 78% de agua, lo que los hace suaves como un trozo de mantequilla al sol y dificulta el manejo de estos cristales frágiles. «Aislar, caracterizar y cristalizar un gramo de PSI, o mil millones de billones de moléculas de PSI, porque los experimentos en su forma totalmente activa fue un gran esfuerzo de los estudiantes e investigadores de mi equipo», dice Fromme. «En el futuro, incluso mayores tasas de repetición y nuevos sistemas de entrega de muestras, el consumo de muestras se reducirá drásticamente «.

El registro y análisis de los datos de difracción fue otro desafío. EuXFEL y DESY desarrollaron un detector de rayos X único para manejar las demandas de los estudios de biología estructural en EuXFEL: el detector de píxeles integradores de ganancia adaptativa, o AGIPD. Cada uno de los 1 millón de píxeles de AGIPD tiene menos de una centésima de pulgada de ancho y contiene 352 celdas de memoria analógica, lo que le permite a AGIPD recopilar datos a velocidades de megahercios en un amplio rango dinámico. Sin embargo, para recopilar datos cristalográficos precisos de microcristales de proteínas de membrana grande se requería un compromiso entre la resolución espacial y el muestreo de los datos.

«Impulsar la recopilación de datos de mayor resolución con el tamaño del detector actual podría impedir el procesamiento útil de los datos cristalográficos porque los puntos de difracción no se resuelven suficientemente por los píxeles del detector de rayos X» advierte Zatsepin «, pero en términos de tasas de datos y rango dinámico, ¿qué? el AGIPD es capaz de hacer es increíble «.

El novedoso software de reducción de datos y análisis cristalográfico diseñado específicamente para enfrentar los desafíos únicos de los conjuntos de datos masivos en la cristalografía XFEL, cuyo desarrollo fue liderado por colaboradores de CFEL, DESY y ASU, ha recorrido un largo camino desde el primer XFEL de alta resolución experimento en 2011.

«Nuestro software y las capacidades informáticas de alto rendimiento de DESY realmente se están poniendo a prueba con los volúmenes de datos sin precedentes generados en EuXFEL. Siempre es emocionante superar los límites de la tecnología de punta», agrega Zatsepin.

Proteínas de membrana: flexibles, pero formidables

Las proteínas de membrana como la PSI, nombradas porque están incrustadas en las membranas celulares, son vitales para todos los procesos de la vida, incluida la respiración, la función nerviosa, la absorción de la nutrición y la señalización de las células. Como se encuentran en la superficie de cada célula, también son los objetivos farmacéuticos más importantes. Más del 60% de todos los medicamentos actuales están dirigidos a proteínas de membrana. Por lo tanto, el diseño de fármacos más efectivos con menos efectos secundarios depende de la comprensión de cómo se unen determinados fármacos con sus proteínas objetivo y sus conformaciones estructurales altamente detalladas y actividades dinámicas.

A pesar de su enorme importancia en biología, las estructuras de proteínas de membrana representan menos del 1% de todas las estructuras de proteínas resueltas hasta la fecha porque son muy difíciles de aislar, caracterizar y cristalizar. Esta es la razón por la cual los avances importantes en los métodos cristalográficos, como el advenimiento de la cristalografía de femtosegundos en serie de megahercios de proteína de membrana, sin duda tendrán un impacto significativo en la comunidad científica.

Se necesita un pueblo

Estos logros recientes no serían posibles sin el esfuerzo incansable de un equipo dedicado de casi 80 investigadores de 15 instituciones, incluidos ASU, el XFEL europeo, DESY, el Centro de Ciencia de Rayos X Ultrarrápidos, el Instituto Hauptman-Woodward, SUNY Buffalo, SLAC , Universidad de Hamburgo, Universidad de Goettingen, Academia Húngara de Ciencias, Universidad de Tennessee, Laboratorio Nacional Lawrence Livermore, Universidad de Southampton, Universidad Tecnológica de Hamburgo, Universidad de Wisconsin. El grupo de investigación incluyó colaboradores estadounidenses en el Centro de Ciencia y Tecnología NSX BioXFEL y un grupo de colaboradores internacionales, incluidos Adrian P. Mancuso y Romain Letrun, científicos líderes en la línea de luz EuXFEL y Oleksandr Yefanov y Anton Barty de CFEL / DESY que trabajaron estrechamente con El equipo de ASU en el análisis de datos complejos.


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