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Un método ‘crisper’ para la edición de genes en hongos


CRISPR / Cas9 es ahora un nombre familiar asociado con los estudios de ingeniería genética. 


por la Universidad de Ciencias de Tokio


A través de la investigación de vanguardia descrita en su artículo publicado en Scientific Reports , un equipo de investigadores de la Universidad de Ciencias de Tokio, la Universidad de Meiji y la Universidad de Agricultura y Tecnología de Tokio, dirigida por el Dr. Takayuki Arazoe y el Profesor Shigeru Kuwata, ha establecido recientemente serie de estrategias novedosas para aumentar la eficacia de la alteración de genes específicos y la «introducción» de nuevos genes utilizando el sistema CRISPR / Cas9 en el hongo de la explosión del arroz Pyricularia (Magnaporthe) oryzae. Estas estrategias incluyen la introducción más rápida (en un solo paso) del gen, el uso de pequeñas secuencias homólogas y la omisión de ciertos «patrones» de ADN del huésped de requisito previo y la modificación del componente del huésped.

El equipo dirigido por el Dr. Arazoe y el Prof. Kuwata ha ideado técnicas rápidas y simples para la edición de genes (alteración de genes objetivo, sustitución de secuencias y reintroducción de genes deseados) utilizando CRISPR / Cas9 en el hongo de la explosión del arroz Pyricularia (Magnaporthe) oryzae , Un tipo de hongo filamentoso. Impulsados ​​por los resultados alentadores, los investigadores suponen que «las plantas y sus patógenos todavía están coevolucionando en la naturaleza. La explotación de los mecanismos de mutación de hongos patógenos modelo como una técnica de edición del genoma podría conducir al desarrollo de nuevas técnicas novedosas en ingeniería genética».

El componente operativo del sistema CRISPR / Cas9 se une a la región del gen objetivo (ADN) y provoca una rotura de doble cadena (DSB) específica del sitio en el ADN. La unión efectiva de este componente requiere un cierto «motivo» o «patrón» llamado protoespaciador adyacente (PAM), que sigue la secuencia del gen diana.

La mayoría de las técnicas de edición del genoma requieren DSB inducidos en el sitio objetivo, lo que desencadena rutas de «reparación» de ADN en el host. La recombinación homóloga (HR) es un mecanismo para la reparación de DSB, y es útil porque agrega secuencias complementarias. Sin embargo, la metodología subyacente es laboriosa y su eficiencia depende convencionalmente de factores externos, como las propiedades del host y las PAM. La HR se puede dividir en dos vías: tipo «no crossover» (conversión de genes) y «crossover». Se sabe que las reparaciones de tipo cruzado se producen en células que sufren meiosis. Sin embargo, la comprensión de su papel en las células que se someten a la mitosis es limitada, y dicha información sobre los hongos filamentosos está prácticamente no disponible. Es esta brecha en el conocimiento que los investigadores buscaban abordar.

En su estudio, los investigadores crearon por primera vez un vector (sistema de administración de genes) basado en CRISPR / Cas9 para confirmar la HR de tipo cruzado en la región del gen receptor en el hongo de la explosión del arroz.

Luego, para verificar la orientación del gen o la «sustitución de secuencia», crearon un vector «mutante», optimizado para HR de tipo crossover único, para la alteración dirigida del gen huésped que codifica la esctalona deshidratasa (SDH), una proteína involucrada en la formación de melanina. Este vector se introdujo en el vector que contiene el gen de la higromicina B fosfotransferasa (hph), que confiere resistencia al antibiótico higromicina B. Los investigadores especularon que la HR de tipo cruzado único insertaría el vector completo junto con el hph en el sitio objetivo. Los mutantes con el gen SDH alterado se identificarían como colonias blancas (debido a la pérdida de melanina) en un medio que contiene higromicina B. Los investigadores encontraron que el número de colonias blancas resistentes a higromicina B aumentó dramáticamente al usar el vector CRISPR / Cas9. lo que significa que el sistema CRISPR / Cas9 es eficaz en la inducción de HR de tipo de cruce único. El mayor beneficio de esta técnica es que necesita secuencias homólogas extremadamente cortas (100 pares de bases; lo que es realmente pequeño en biología molecular).

Los investigadores también utilizaron una estrategia similar para verificar si la introducción del gen (o «detonación») es posible a través de una HR de tipo cruzado simple utilizando un vector CRISPR / Cas9. Utilizaron el gen de la proteína verde-fluorescente (GFP), que se usa ampliamente como un gen «informador» para hacer que las células huésped se iluminen de verde fluorescente cuando se insertan en su genoma. Especularon que un solo cruce de recursos humanos daría lugar a la introducción de GFP en la secuencia del destinatario. De hecho, encontraron que el uso del vector CRISPR / Cas9 dio lugar a colonias fluorescentes verdes en medio de higromicina. Estos hallazgos muestran que el sistema CRISPR / Cas9 se puede usar para la incorporación eficiente de genes de «un solo paso».

Esta investigación apunta hacia un hecho sorprendente de que, tal vez, los PAM no son tan necesarios para la edición del gen CRISPR / Cas9 en hongos. Tras el éxito de la investigación, el equipo afirma: «Hemos encontrado que los hongos filamentosos tienen características genómicas únicas, en las que los cruces se inducen con frecuencia, incluso en células somáticas, al dividir el ADN objetivo. Utilizamos estas características para interrumpir el ADN objetivo y para introducir genes «informadores» . También logramos aumentar la eficiencia y la velocidad de los detonadores mediante un proceso de un solo paso. Esta tecnología supera la restricción que plantean los PAM, que es una de las mayores desventajas de CRISPR / Cas9. sistema, y ​​permite una edición más flexible del genoma, que ha sido difícil en estudios previos sobre hongos filamentosos «.

Finalmente, cuando se le preguntó sobre las aplicaciones más amplias de esta investigación, el Dr. Arazoe y el Prof. Kuwata afirman con elocuencia que «el hongo de la explosión del arroz es un patógeno importante que causa la enfermedad destructiva del arroz, que es el alimento básico del país. CRISPR / Cas9- La técnica de edición del genoma desarrollada en nuestro estudio puede acelerar la investigación de biología molecular de este patógeno y, en última instancia, contribuir al suministro estable de alimentos y la seguridad alimentaria a base de plantas. Además, esta técnica es aplicable a otros hongos filamentosos ampliamente utilizados en la industria, especialmente en el bioprocesamiento. , alimentos, y las industrias de fermentación «.


Más información: Tohru Yamato et al, Sustitución de nucleótidos dirigida mediada por un solo cruce y estrategias de inserción con el sistema CRISPR / Cas9 en el hongo de la ráfaga de arroz, Scientific Reports (2019). DOI: 10.1038 / s41598-019-43913-0Información de la revista: Informes científicos.Proporcionado por la Universidad de Ciencias de Tokio


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