Los investigadores de la Universidad Estatal de Carolina del Norte continúan impulsando el campo del diagnóstico de enfermedades de las plantas, desarrollando pruebas fáciles de ejecutar capaces de entregar resultados en minutos, a veces antes de que las plantas muestren signos visibles de enfermedad.
Por Dee Shore, Universidad Estatal de Carolina del Norte
En un artículo publicado en el último número de la revista Phytopathology , la fitopatóloga de NC State, Jean Ristaino, y su estudiante de posgrado, Amanda Mainello-Land, quien recientemente obtuvo su doctorado, informan sobre su éxito al crear pruebas para determinar si los rododendros han sido infectados por Phytophthora ramorum, un tipo de moho acuático conocido como oomiceto.
Los investigadores se centraron en P. ramorum porque representa una amenaza importante para los árboles forestales y las plantas de vivero, como rododendros, camelias y viburnos, e impacta los ecosistemas forestales y las industrias comerciales que sustentan.
La enfermedad más notoria que causa el patógeno es la muerte súbita del roble, que ha matado millones de árboles en California y Oregón y ha estimulado regulaciones y cuarentenas estatales y federales en los Estados Unidos y en el extranjero.
Como becario Fulbright en año sabático en Irlanda, Ristaino demostró las pruebas a principios de este año a un grupo de forestales en el condado de Wicklow, donde P. ramorum ha infectado árboles de alerce cultivados en plantaciones forestales.
«El patógeno ha matado millones de alerces plantados en Irlanda, un país que depende de las plantaciones forestales para obtener madera», dijo Ristaino.
Herramienta para ayudar a los protectores de bosques y viveros
Ristaino dijo que las pruebas genéticas que desarrolló su equipo brindarán a quienes administran y protegen los bosques y viveros el tipo de información que necesitan más rápidamente para evitar que la enfermedad se propague.
Debido a que el comercio de plantas de vivero es una ruta importante para el movimiento de P. ramorum desde áreas del oeste de los Estados Unidos y una ruta potencial para invasiones a los bosques, se realizan estudios de vivero de manera rutinaria en muchos estados para detener la propagación, rastrear el movimiento del patógeno e identificar linajes.
Se envían muestras para su análisis a laboratorios certificados en Estados Unidos y Europa, pero la mayoría de las muestras resultan ser falsas alarmas , dijo Ristaino, profesor William Neal Reynolds en el Departamento de Entomología y Fitopatología y miembro de la facultad de la Iniciativa de Ciencias Vegetales de Carolina del Norte. Muchas otras especies de Phytophthora infectan árboles forestales y plantas ornamentales leñosas.
«En la actualidad, los laboratorios suelen utilizar ensayos de PCR en tiempo real muy largos y prolongados que toman días o semanas para recolectar primero la muestra, enviarla a la clínica de enfermedades de las plantas, ejecutar el ensayo y luego enviar la información a los reguladores estatales y a la gente en el campo», dijo.
Una opción de prueba sencilla y económica
Ristaino y sus colaboradores comparan eso con los 20 a 30 minutos que lleva ejecutar las pruebas que desarrolló el equipo.
Las pruebas se denominan ensayos LAMP LyoBead porque utilizan LyoBeads y una tecnología conocida como amplificación isotérmica mediada por bucle. LAMP emplea iniciadores especialmente diseñados para reconocer segmentos de ADN característicos de P. ramorum, y los LyoBeads son perlas liofilizadas que cambian de color cuando se exponen a patógenos específicos.
Los investigadores desarrollaron LyoBeads que contienen todos los reactivos necesarios para realizar la prueba en un solo tubo. Se añade el ADN de plantilla y el tampón y, a continuación, se puede utilizar un pequeño bloque de calor portátil, alimentado por el encendedor de un vehículo o una batería solar, para realizar los ensayos en el campo a 65 grados C durante 15 minutos mientras se amplifica el ADN.
Ristaino explicó que las muestras también se pueden cargar en un portaobjetos de microfluidos y calentar en un casete de un teléfono inteligente o en el bloque térmico. La cámara del teléfono inteligente se puede utilizar para fotografiar los resultados, o un simple cambio de color visual de violeta a azul en el tubo significará que las muestras son positivas.
El equipo de Ristaino desarrolló cuatro ensayos: uno muestra si una muestra ha sido infectada con alguna especie de Phytophthora que se sabe que infecta a los huéspedes objetivo, y otros dos muestran si la especie infectante es P. ramorum o P. kernoviae, una especie preocupante en el Reino Unido y Europa que aún no ha aparecido en los Estados Unidos. También han desarrollado la prueba LAMP para detectar el linaje más común de P. ramorum encontrado en los Estados Unidos, el linaje NA-1.
Anteriormente, Ristaino y sus colaboradores habían desarrollado pruebas similares para P. infestans, que causa enfermedades importantes en la papa y el tomate y fue responsable de la histórica hambruna de la papa en Irlanda.
Ristaino dijo que el ensayo LyoBead LAMP es escalable a otros patógenos de plantas, siempre que se creen cebadores específicos para atacar al patógeno de interés.
Estas pruebas económicas y sencillas pueden acelerar el diagnóstico, reduciendo las pruebas de laboratorio o eliminando su necesidad, dijo Ristaino.
«El ensayo puede reducir en gran medida el flujo de trabajo en los laboratorios de diagnóstico de plantas, ya que la detección en campo de P. ramorum elimina otras especies de Phytophthora menos importantes que podrían enviarse a los laboratorios», dijo.
Los resultados de la detección también pueden vincularse a bases de datos públicas o privadas y utilizarse en sistemas de vigilancia de enfermedades y de modelado de riesgos para coordinar la contención de la enfermedad.
Más información: Amanda Mainello-Land et al, Detección de amplificación isotérmica mediada por bucle de Phytophthora kernoviae, P. ramorum y el linaje NA1 de P. ramorum en una plataforma de chip y teléfono inteligente microfluídico, Phytopathology (2025). DOI: 10.1094/PHYTO-02-24-0055-R
