La metodología beneficia al sector agrícola, al facilitar la detección de las que están inmaduras o son de mala calidad, sin destrucción ni generación de residuos
AGENCIA FAPESP/DICYT – Científicos del Centro de Energía Nuclear en la Agricultura (Cena) y de la Escuela Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz” (Esalq), ambos de la Universidad de São Paulo (USP), en Brasil, desarrollaron una metodología basada en la inteligencia artificial que permite automatizar y dotar de una mayor eficiencia al proceso de examen de la calidad de las semillas, que se exige por ley y que actualmente es ejecutado en forma manual por analistas acreditados por el Ministerio de Agricultura, Ganadería y Abastecimiento (MAPA) nacional.
El grupo empleó tecnologías basadas en la luz –ya aplicadas en el análisis de plantas y en áreas como la de cosmética– para la toma de imágenes de las semillas. Y luego echó mano de técnicas de aprendizaje de máquinas para automatizar el proceso de interpretación de las imágenes. De este modo, fue posible minimizar algunas de las dificultades halladas en los procesos tradicionales. Para diversas especies, esta nueva tecnología puede aplicarse a todo el lote de semillas y no solamente a las muestras, por ejemplo, tal como se hace actualmente. Asimismo, al ser no invasiva, la misma evita destruir los productos analizados, con su consiguiente producción de residuos.
En la investigación, los científicos emplearon dos tecnologías basadas en la luz para la obtención de las imágenes: la fluorescencia de clorofila y la reflectividad multiespectral, teniendo como modelos a las semillas de tomates y de zanahorias producidas en distintos países y en diversas épocas, sometidas a variadas condiciones de almacenamiento. En el caso de las semillas de tomateros, se utilizaron los cultivares comerciales Gaúcho y Tyna, producidos en Brasil y en Estados Unidos. Para las zanahorias, se seleccionaron los cultivares Brasília y Francine, producidos en Brasil, Italia y Chile.
Esta selección se basó en la importancia económica de dichos alimentos, cuya demanda ya es grande en todo el mundo y que sigue expandiéndose, sumada a las dificultades que los productores encuentran en la cosecha de las semillas. Como estos cultivos no exhiben uniformidad en el proceso de maduración de sus frutos y, por consiguiente, de sus semillas, los productores deben efectuar la cosecha en parcelas, lo que es sumamente oneroso. Y aparte persiste aún una gran dificultad para la obtención de lotes uniformes, pues la presencia de semillas inmaduras no se detecta fácilmente mediante métodos visuales. Las técnicas basadas en visión artificial pueden minimizar ese problema.
Los investigadores compararon los resultados obtenidos en los análisis no destructivos con los de los exámenes aplicados a las semillas mediante el empleo de los métodos tradicionales: el ensayo de germinación, obligatorio por ley, y el de vigor. En el primero, los analistas separan muestras de semillas, las ponen a germinar en condiciones favorables de temperatura, agua y oxígeno y verifican la cantidad final de plántulas −o plantas jóvenes− normales producidas de acuerdo con las reglas estipuladas por el Mapa. En tanto, los ensayos de vigor son complementarios, y son más sofisticados. Los más comunes se basan en la respuesta de las semillas a las condiciones de estrés y en parámetros de crecimiento de las plántulas.
Amén de las dificultades mencionadas, los métodos tradicionales son más lentos. En el caso del tomatero y de la zanahoria, por ejemplo, la obtención de los resultados puede tardar dos semanas. Asimismo, el análisis es bastante subjetivo, pues depende de la interpretación de cada analista. “Nuestra propuesta consiste en automatizar al máximo este proceso aplicando fluorescencia de clorofila y empleando imágenes multiespectrales para analizar la calidad de las semillas, a los efectos de superar esos cuellos de botella”, destaca Clíssia Barboza da Silva, investigadora del Cena-USP y una de las autoras de artículo publicado en la revista Frontiers in Plant Science, uno de los principales periódicos científicos internacionales del área de la agricultura. Barboza da Silva también es la investigadora responsable del proyecto, que cuenta con el apoyo de la FAPESP – Fundación de Apoyo a la Investigación Científica del Estado de São Paulo.
La autora principal del artículo es Patrícia Galletti, quien llevó adelante la investigación durante su maestría y obtuvo el premio Best Poster Award en el marco del 7º Congreso de Semillas de las Américas, en el año 2019, donde presentó resultados parciales del proyecto.
La clorofila como marcador de calidad
La clorofila se encuentra presente en las semillas, donde ayuda a suministrar energía para el almacenamiento de nutrientes (lípidos, proteínas e hidratos de carbono) importantes para el desarrollo. Una vez que cumple esta función, se degrada. “Con todo, cuando las semillas no culminan el proceso de maduración, queda clorofila no degradada alojada en su interior. Cuanto menor es la cantidad de clorofila residual, más avanzadas estarán las semillas en el proceso de maduración, más nutrientes poseerán y más alta será su calidad. Si hay mucha clorofila, sucede lo contrario: las semillas aún están inmaduras y son de una menor calidad”, informa.
Tal como lo explica la investigadora, la clorofila es altamente fluorescente, es decir que posee la capacidad de emitir luz cuando se la expone a radiaciones con longitudes de onda específicas. Esto sucede porque la energía proveniente de la luz que incide sobre la muestra de semillas no se aprovecha totalmente, y una parte se pierde por fluorescencia. El empleo de luz en las longitudes de onda de la franja del rojo es eficiente para promover la excitación de la clorofila, que se vuelve fluorescente. Esa luz que “sobra” es entonces capturada por el aparato, que la convierte en una señal eléctrica y genera una imagen cuyos píxeles en tonos de gris varían desde el blanco hasta el negro. Los tonos más blancos indican que las semillas poseen una mayor cantidad de clorofila, que emitió fluorescencia al sometérsela a la luz roja. Esto significa que las semillas están más inmaduras y que las posibilidades de que no germine son considerablemente mayores.
Inteligencia artificial
La otra tecnología para la cual los investigadores desarrollaron una metodología aplicable al análisis de la calidad de las semillas es la de reflectividad multiespectral. Los LED del equipo emiten luz en longitudes de onda en el rango visible y no visible para el ojo humano (ultravioleta e infrarrojo cercano). En la investigación con reflectividad para el análisis de calidad, los científicos utilizaron 19 longitudes de onda. Cuando los compararon con los datos de evaluación de calidad realizados mediante métodos tradicionales, observaron que los mejores resultados se obtuvieron con el infrarrojo cercano en el caso de las semillas de zanahorias y con el ultravioleta para las de tomate.
Las semillas poseen proteínas, lípidos y azúcares que absorben parte de la luz que emiten los LED y reflejan otra parte. La luz que reflejan es capturada por el aparato, que registra las imágenes. Estas pasarán por una segmentación, que consiste en la separación de las semillas del soporte donde están ubicadas en el equipo. Mediante el empleo de esta técnica, el soporte se transforma en pixeles de valor cero y es de color negro, y las imágenes de las semillas se generan en la escala del gris. El valor de los píxeles que componen una semilla está relacionado con su composición química. “No trabajamos únicamente con un resultado promedio de la muestra: conseguimos efectuar una extracción individualizada de cada semilla”, destaca la investigadora.
“Cuanto mayor es la concentración de un determinado nutriente en las semillas, menos se reflejará en una longitud de onda específica, pues tendrán más de ese nutriente absorbiendo aquella luz. Cuando tienen menos nutriente, significa que existen menos moléculas para absorber la luz, y así la reflectividad será mayor, pero esto variará de acuerdo con el componente presente, que exhibe un comportamiento distinto de acuerdo con la longitud de onda utilizada”, explica. Un algoritmo logra identificar la longitud de onda que obtiene el mejor resultado. Este proceso suministra información sobre la composición química de las semillas, lo cual permite inferir si las mismas poseen alta o baja calidad.
A juicio de los investigadores, no era suficiente llegar a la etapa de obtención de las imágenes, pues esto constituye todavía una operación que requiere de la observación humana. “Por eso aplicamos la quimiometría, un conjunto de métodos estadísticos empleados para la clasificación de materiales de origen químico. La idea era que el equipo nos suministrase la clasificación de la calidad con base en la imagen que registró”, comenta. Los métodos que los científicos aplicaron en este estudio son muy utilizados en el área médica y en la de alimentos.
Los profesionales emplearon luego el aprendizaje de máquinas para poner a prueba los modelos que elaboraron con base en los métodos quimiométricos. “Le enseñamos al modelo qué son las semillas de alta y de baja calidad. Utilizamos el 70% de nuestros datos para entrenarlo y el 30 % restante sirvió para la validación”, comenta. Para los tomates, la identificación correcta de la calidad de las semillas varió del 86% al 95%. Para las zanahorias, entre el 88% y el 97%.
Aparte del alto nivel de precisión, los investigadores destacan que ambas tecnologías agilizan la ejecución de los análisis porque es posible capturar las imágenes muy rápidamente. En el aparato de fluorescencia de clorofila, el tiempo de captura de imágenes es de un segundo. Y son cinco segundos para capturar 19 imágenes en el equipo con tecnología multiespectral.
Resultados inesperados
Durante el desarrollo del proyecto, un hallazgo inesperado se mostró sumamente relevante. Las tecnologías de fluorescencia de clorofila y multiespectral también son útiles en el proceso de separación de cultivares. Se trata de una operación esencial para analizar un lote de semillas y evitar pérdidas económicas. “Los productores pueden comprar lotes de semillas esperando que las plantas generen un determinado rendimiento, pero si no se separan bien las semillas con características genéticas distintas, la producción acusará el impacto”, afirma. Actualmente, esto queda a cargo de analistas capacitados para verificar patrones que pueden aplicarse al efectuar la separación (de color, de forma y de tamaño de las semillas; y, de ser posible, marcadores moleculares).
Para las zanahorias, las dos tecnologías utilizadas en la investigación se mostraron eficaces en la separación de variedades. En tanto, para los tomateros, la tecnología multiespectral no funcionó bien, mientras que la de fluorescencia fue eficaz. “Nuestro estudio aporta resultados inéditos con relación al uso de esta tecnología para la separación de cultivares. No encontramos registros de investigaciones en las cuales se haya utilizado la fluorescencia con este fin”, celebra. “En tanto, con respecto a la reflectividad, existen algunos trabajos que muestran que es eficiente en la separación de cultivares, pero no con el aparato que nosotros utilizamos”, prosigue.
Uso compartido
Para Barboza da Silva, una forma de transferirle el conocimiento elaborado en la investigación al sector productivo consiste en que haya empresas que desarrollen los aparatos para su venta a los productores de semillas. “Con los resultados de nuestra investigación, sería posible desarrollar un equipo que utilice únicamente luz ultravioleta para caracterizar la calidad de las semillas de tomates y sacarlo al mercado, por ejemplo.”
Los tres aparatos utilizados en el estudio se encuentran actualmente disponibles para los investigadores de otras instituciones en el Cena-USP, en el sistema multiusuarios. El de fluorescencia se creó específicamente para esta investigación. El fabricante posee la tecnología para el análisis de plantas y adaptó el equipo para la realización del análisis de las semillas.
Los investigadores también adquirieron un aparato de rayos X para poder observar el interior de las semillas y confirmar la presencia o la ausencia, como así también la extensión, de tejidos especializados en el almacenamiento de nutrientes.
